För att uppnå signalförstärkning för spårmängder av virala nukleinsyror och tillhandahålla tillräckligt med substrat för Cas14a, utvecklade vi aMIRA (asymmetrisk multienzyme isotermisk snabbförstärkning) baserad på MIRA. Det resulterande aMIRA-Cas14a-systemet erbjuder följande viktiga fördelar:
1. Optimerad primerstökiometri tillåter MIRA att företrädesvis överproducera ssDNA, som fungerar som det direkta substratet för Cas14a. Genom att justera framåt-till-omvänd primerförhållandet till 20:1, genererar systemet tillräckligt med ssDNA för att aktivera den PAM-oberoende klyvningsaktiviteten av Cas14a, som specifikt känner igen och klyver ssDNA.
2. One-pot-integrering av MIRA och CRISPR-Cas14a eliminerar korskontamineringsrisker.
3. MIRA ökar avsevärt detektionskänsligheten, vilket möjliggör detektering av virala nukleinsyror med ultralåg förekomst.
4. aMIRA-Cas14a upprätthåller hög specificitet och undviker falska positiva resultat orsakade av icke-specifik amplifiering.
I slutändan eliminerar one-pot-integreringen av MIRA och CRISPR-Cas14a kontamineringsrisker och uppnår perfekt synergi mellan MIRAs styrkor och CRISPR-Cas14a-systemet. Detta löser den branschövergripande utmaningen med inkompatibilitet mellan isotermisk förstärkning och CRISPR-system, vilket representerar det centrala tekniska genombrottet för MaC14a-plattformen. aMIRA-Cas14a-systemet uppnår en 1 000-faldig förbättring av känsligheten samtidigt som det säkerställer specifik förstärkning. I kombination med den sekvensspecifika igenkänningen av Cas14a ger detta dubbelskiktsspecificitetsvalidering, utan korsreaktivitet mot icke-målvirus eller friska prover{13}}som tar itu med en annan branschvärkpunkt: tendensen till falska positiva.
MIRA multienzym isotermiska snabbförstärkningsreagenser som används i denna studie tillhandahålls av Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Förutom utmärkta reagensprestanda erbjuder Amp‑future Biotech också ett professionellt och snabbt responsivt tekniskt supportteam.
MIRA visar stark kompatibilitet med centrifug-baserade mikrofluidchips utvecklade för forskning och diagnostiska tillämpningar:
1. Miniatyriserat reaktionssystem, lämpligt för reaktionskammare med mikro-volymer som är karakteristiska för mikrofluidchips;
2.Multiplexdetekteringsförmåga i en enda körning;
3.Kompatibilitet med bärbara enheter, smidiga arbetsflöden från prov till resultat.
vi konstruerade en integrerad bärbar "sample-in, answer-out" point-of-care testing (POCT)-enhet optimerad för fältdistribution, som illustreras i Fig. 4A. Den kompakta prototypen (23 cm (L) × 21 cm (B) × 14 cm (H), 12,5 kg total vikt) uppnår exceptionell bärbarhet. Systemets kärnkomponenter inkluderar en{11}}högprecisionsservomotor för exakt rotationskontroll och en luftvärmeenhet för temperaturreglering. En integrerad optisk detektionsmodul, placerad under chipet, underlättar fluorescensexcitering och mätning, vilket säkerställer hög känslighet och noggrannhet vid detektion. Den bärbara enheten är utrustad med ett inbäddat Android-operativsystem som erbjuder ett användarvänligt-gränssnitt där operatörer kan välja förprogrammerade driftfiler som innehåller detaljerade parametrar som reaktionstid och temperatur. Resultat och slutsatser visas i realtid-på en LCD-skärm, vilket möjliggör snabb informationsinhämtning. Dessutom innehåller systemet en trådlös kommunikationsmodul som stöder dataöverföring i{18}}realtid till mobila enheter eller molnservrar, integrerad med artificiell intelligensalgoritmer för omedelbar tolkning och analys av testresultat.
