DNA -polymeras är ett avgörande enzym i molekylärbiologi som spelar en central roll i DNA -replikations- och reparationsprocesser. I laboratoriet är rening av DNA -polymeras en noggrann och multi -stegprocess som kräver noggrann planering och genomförande. Som DNA -polymerasleverantör är jag välkänd i komplikationerna i denna reningsprocess, och jag skulle vilja dela detaljerna med dig.
Inledande steg: Celltillväxt och lys
Det första steget i rening av DNA -polymeras börjar ofta med växande celler som uttrycker enzymet. Vanligtvis används bakterier såsom Escherichia coli som värdceller eftersom de är enkla att odla, växa snabbt och kan genetiskt konstrueras för att överuttrycka mål -DNA -polymeraset. Bakterierna odlas vanligtvis i ett lämpligt odlingsmedium under kontrollerade förhållanden för temperatur, pH och luftning. Till exempel odlas E. coli ofta vid 37 ° C i ett rikt medium som Luria - Bertani (LB) buljong.
När cellerna har nått en lämplig densitet skördas de genom centrifugering. Cellpelleten återsuspenderas sedan i en buffertlösning. För att frisätta DNA -polymeraset från cellerna utförs ett lyssteg. Det finns flera metoder för celllys, inklusive mekaniska metoder (såsom sonikering), kemiska metoder (med användning av tvättmedel som Triton X - 100) och enzymatiska metoder (med användning av lysozym för att bryta ner bakteriecellväggen). Sonikering är ett populärt val eftersom det effektivt kan störa cellerna utan att orsaka betydande skador på enzymet. Det måste emellertid kontrolleras noggrant för att undvika över - uppvärmning av provet, vilket kan denaturera DNA -polymeraset.
Rå extraktberedning och förtydligande
Efter celllyser innehåller den resulterande blandningen en mängd cellulära komponenter, inklusive proteiner, nukleinsyror, lipider och cellskräp. Detta kallas det råa extraktet. För att ta bort det stora skala skräpet centrifugeras det råa extraktet med hög hastighet. Supernatanten, som innehåller de lösliga proteinerna inklusive DNA -polymeraset, samlas noggrant.
Ibland kan det råa extraktet fortfarande innehålla en betydande mängd nukleinsyror som kan störa de efterföljande reningsstegen. För att avlägsna dessa nukleinsyror kan ett nederbördssteg utföras med användning av en polykationisk förening såsom polyetylenimin (PEI). PEI binder till de negativt laddade nukleinsyrorna och får dem att fälla ut, vilket sedan kan avlägsnas genom centrifugering.
Kromatografisk rening
Kromatografi är hörnstenen i DNA -polymerasrening. Det finns flera typer av kromatografitekniker som kan användas, var och en baserat på olika principer för separation.
Ion - Exchange Chromatography
Ion - Utbyteskromatografi är ofta det första kromatografiska steget i reningsprocessen. Det skiljer proteiner baserat på deras nettoladdning. DNA -polymeraser har en karakteristisk laddning vid ett givet pH, vilket gör att de kan binda till antingen en positivt laddad (anjon - utbyte) eller negativt laddad (katjon - utbyte) harts. Till exempel, om DNA -polymeraset har en netto negativ laddning vid ett visst pH, kan ett anjon - utbytesharts såsom dietylaminoetyl (DEAE) cellulosa användas. Det råa extraktet laddas på kolonnen, och DNA -polymeraset binder till hartset medan andra proteiner med olika laddningar passerar igenom. Det bundna DNA -polymeraset kan sedan elueras genom att öka saltkoncentrationen i bufferten. Denna metod är effektiv för att ta bort många föroreningar och kan berika DNA -polymeraset signifikant i provet.
Affinitetskromatografi
Affinitetskromatografi är en mycket specifik reningsmetod. Det drar nytta av den specifika interaktionen mellan DNA -polymeraset och en ligand immobiliserad på ett harts. Ett vanligt tillvägagångssätt är att använda ett His -tagsystem. Om DNA -polymeraset har genetiskt konstruerats för att innehålla en histidin -tagg (HIS - TAG) kan en nickel -nitrilotrietiksyra (Ni - NTA) -harts användas. His - Tag binds specifikt till nickeljonerna på hartset, vilket gör att DNA -polymeraset kan bibehållas selektivt på kolonnen. Andra proteiner som inte har His - taggen kommer att passera genom kolumnen. Det bundna DNA -polymeraset kan elueras genom att tillsätta imidazol till bufferten, som konkurrerar med hans - tagg för bindning till nickeljonerna.
En annan typ av affinitetskromatografi som kan användas är DNA -affinitetskromatografi. Eftersom DNA -polymeras har en naturlig affinitet för DNA, kan ett DNA -innehållande harts användas. DNA -polymeraset binder till DNA på hartset, och andra icke -DNA -bindande proteiner avlägsnas. Det bundna DNA -polymeraset kan sedan elueras genom att ändra buffertförhållandena, såsom att öka saltkoncentrationen eller tillsätta ett konkurrent -DNA.
Storlek - Uteslutningskromatografi
Storlek - Uteslutningskromatografi, även känd som gel -filtreringskromatografi, separerar proteiner baserat på deras storlek. Kolonnen är fylld med porösa pärlor. Mindre proteiner kan komma in i porerna i pärlorna och ha en längre väg genom kolonnen, medan större proteiner passerar genom utrymmen mellan pärlorna och eluerar tidigare. Denna metod är användbar för att ta bort alla återstående aggregat eller små - molekylära viktföroreningar. Det kan också användas för att bestämma molekylvikten för det renade DNA -polymeraset.
Slutlig rening och kvalitetskontroll
Efter de kromatografiska stegen är DNA -polymeraset vanligtvis mycket renat. Det kan dock fortfarande finnas några mindre föroreningar närvarande. Ett slutligt poleringssteg, såsom hydrofob interaktionskromatografi eller omvänd faskromatografi, kan utföras för att ytterligare rena enzymet.
När rening är klar är rigorösa kvalitetskontrollåtgärder väsentliga. Renheten hos DNA -polymeraset kan bedömas med användning av tekniker såsom natriumdodecylsulfat - polyakrylamidgelelektrofores (SDS - PAGE). Ett enda band på gelén indikerar ett högt renhetsprov. Aktiviteten för DNA -polymeraset kan mätas med användning av en in vitro -DNA -syntesanalys. Den specifika aktiviteten, som är mängden enzymaktivitet per proteinenhet, är en viktig parameter för att utvärdera kvaliteten på det renade DNA -polymeraset.
Andra relaterade enzymer och vår produktportfölj
Förutom DNA -polymeras erbjuder vårt företag också en rad andra högkvalitativa enzymer för laboratorieforskning. Till exempel har viGP41 -protein 2.0, som spelar en viktig roll i DNA -replikationsprocesser. En annan produkt ärExonukleas III 2.0, vilket är användbart för DNA -reparations- och modifieringsstudier. Och vårSC Reca 2.0är involverad i homolog rekombination och DNA -reparationsmekanismer.
Slutsats
Reningen av DNA -polymeras i laboratoriet är en komplex men givande process. Genom noggrann celltillväxt, lysering, kromatografisk rening och kvalitetskontroll kan vi erhålla mycket rent och aktivt DNA -polymeras. Som DNA -polymerasleverantör är vi engagerade i att tillhandahålla produkter av högsta kvalitet för att tillgodose det vetenskapliga samfundets behov. Om du är intresserad av vårt DNA -polymeras eller andra enzymprodukter, inbjuder vi dig att kontakta oss för upphandling och ytterligare diskussioner. Vi är alltid redo att erbjuda professionell rådgivning och support för att säkerställa att du har de bästa lämpliga reagensen för dina forskningsprojekt.
Referenser
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). Molekylär kloning: En laboratoriehandbok. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- SCOPES, RK (1994). Proteinrening: Principer och praxis. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Guide till proteinrening. Academic Press.